Southern blot para detectar la Entamoeba histolytica

Para el análisis se recolectó alrededor de 5g de heces frescas. Para identificar las cepas, se utilizaron cebadores diseñados a partir de las secuencias flanqueantes de diferentes copias de EhSINE1 y EhSINE2, obtenidas de la base de datos E. histolytica HM-1:IMSS. Después, el cebador SINE se ejecutó en gel de agarosa y se transfirió a una membrana GeneScreen. Luego, las sondas marcadas radiactivamente se prepararon utilizando α-32PedATP mediante cebado aleatorio.

HIBRIDACIÓN

1.- Se hizo durante la noche a 65 °C en tampón de hibridación con sondas de ADN específicas de locus.
2.- La membrana fue lavada dos veces a temperatura ambiente en 2x SSC.
3.- Seguido de 2x SSC y SDS al 1% a 65 °C durante 7 minutos.
4.- Dos veces expuesta con 0,1x SSC durante 20 minutos a temperatura ambiente.
5.- Por último, fue escaneada con fósforo reproductor de imágenes.

De 187 muestras analizadas, 70 muestras fueron positivas para E. histolytica o E. dispar, basados en los loci polimórfico EhSINE1 y EhSINE2.

Imagen obtenida de: https://www.ecured.cu/images/c/cc/Southern.jpg

Bibliografía:

1. Sharma S, Banyal N, Singh M, Mandal A, Bhattacharya S. El polimorfismo SINE revela distintas cepas de Entamoeba histolytica del norte de la India [Internet]. Parasitología Experimental. 2017 [citado el 09 de enero de 2022]. Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0014489416302302?via%3Dihub

PCR para detectar la Entamoeba histolytica (Ecuador)

De 106 muestras de heces recolectadas de las provincias de Esmeraldas y Pichincha el 100% fueron positivas para E. histolytica/dispar por microscopía óptica. Por otro lado, al extraer ADN usando QlAamp kit taburete para realizar una Amplificación de ADN mediante PCR en tiempo real (RT-PCR), los ciclos consistieron en:

• 3 minutos a 95°C seguidos de 40 ciclos de:
• 🠉Desnaturalización: 15 segundos a 95°C
• 🠋Hibridación: 30 segundos a 60°C
• 🠉Extensión: 30 segundos a 72°C

La eficacia de la reacción de amplificación se comprobó mediante un corrido electroforético para analizar estos amplicones, se utilizó la secuencia de gen ARNr 18S con fragmentos específicos para E. histoytica (439bp) y E. dispar (174bp). El análisis de datos se realizó con el DA7600 RT PCR y los resultados fueron 74 positivos para E. dispar, 3 positivos para E. histolytica, y 29 fueron negativas para E. histolytica o E. dispar, pudiendo tratarse de E. mosksvskii.

Detección y diferenciación de Entamoeba histolytica/dispar mediante PCR. Imagen obtenida de: https://blogger.googleusercontent.com/img/proxy/AVvXsEjhg7I-FCIO8lsmpEWC0voeezbhhn1wSEz3OdoW9cFq7vPdhfC7POefxsQJZYWhGQS5gStH22867kGYJrbRD6QnilMGVPz-fcsTf5g9uWueE1JRg6naV114cZq0oxETmTwtv_4QQsKiNRtA8oKzUSixnOkwB7_VzZ_YMnPk7kDJspU=

Bibliografía:

1. Guevara A, Vicuña Y, Costales D. Uso de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para diferenciar entre Entamoeba histolytica patógena y Entamoeba dispar no patógena en Ecuador [Internet]. 2019 [citado el 23 de diciembre d 2021]. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30398142/

2. Rivero Z, Villarreal L, Bracho A. Identificación molecular de Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar y Entamoeba moshkovskii en niños con diarrea en Maracaibo, Venezuela [Internet]. 2021 [citado el 23 de diciembre de 2021]. Disponible en: https://revistabiomedica.org/index.php/biomedica/article/view/5584/4866

Tres pasos básicos para la extracción del ácido nucleico

 Separación Magnética de Alto Gradiente (HGMS) 

Las muestras fueron: esputo, orina y suero humano, la eficiencia de captura de ADN supera el 90%.

1.- Lisis celular.- Combinación de irradiación con láser y perlas magnéticas terminadas en carboxilo, con efecto fototérmico.

2.- Separación.- Se utiliza un imán externo para mover perlas magnéticas recubiertas de sílice a través de soluciones tampón.

3.- Aislamiento de AN.- Las perlas magnéticas se capturaron en la matriz de lana de acero, magnetizada debido a la fuerza magnética dominante ejercida sobre las perlas.

(2) Esquema de captura de perlas magnéticas usando HGMS

Bibliografía:

1.- Rajesh P, Ostermann E, Qingshan W. Avances en tecnologías de extracción de ácido nucleico en el punto de atención para el diagnóstico rápido de enfermedades humanas y vegetales [Internet]. 2020 [citado 14 de diciembre de 2021]. Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956566320305820?via%3Dihub

2.- Pearlman S, Leelawong M, Richardson K. Métodos de extracción de ácidos nucleicos de bajos recursos habilitado por separación magnética de alto gradiente [Internet]. 2020 [citado 14 de diciembre de 2021]. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32039572/

3 Normas básicas de bioseguridad en el laboratorio de Biología Molecular

 1.- Utilizar de forma adecuada la indumentaria de protección que consta de bata, guantes, gafas, mascarillas y zapatos antideslizantes.

2.- Leer la guía de laboratorio para saber como preparar los materiales y equipos, también para conocer la toxicidad o riesgo de los reactivos con los que se va a trabajar.

3.- Etiquetar y organizar todos los productos químicos, así mismo, descontaminar las superficies e instrumentos que se utilizaron.

Bibliografía:

1.- Asociados - Fondecyt - CONICYT. Manual de Normas de Bioseguridad y Riesgos [Internet]. 2019 [citado 08 de diciembre de 2021]. Disponible en: https://www.conicyt.cl/fondecyt/files/2018/06/Manual-_Bioseguridad-_junio_2018.pdf

2.- Ortiz Y. Normas de seguridad en el laboratorio [video en internet]. Youtube. 06 de Abril de 2020. [citado 08 de diciembre de 2021]. Disponible en: https://www.youtube.com/watch?v=gJnJr-W8gmE&t=168s

 

Hola a todos, mi nombre es Cristian Cárdenas, les doy la cordial bienvenida a mi blog, un espacio educativo a través del cual tendré el placer de compartir con ustedes valiosa información sobre Biología celular y molecular. Mi objetivo principal es dedicar tiempo y esfuerzo en cada una de mis investigaciones para poder brindar aportes de calidad que permitan fortalecer el conocimiento, estoy completamente seguro que a lo largo de esta nueva experiencia aprenderemos juntos a ser unos excelentes profesionales de la salud. 

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